on label="Powered by 135editor.com" style="white-space: normal;">论文DOI：10.1021/acscatal.0c03767 传统甲壳素水解法生产氨基葡萄糖（glucosamine，氨糖）环境污染严重，存在产业技术升级的重大需求。在本研究中，作者开发了基于磷酸酶的体外多酶体系（in vitro synthetic enzymatic biosystem）生产氨糖的新方法，该新型氨糖制造平台可操作性强、优化放大容易、绿色安全。
氨基葡萄糖是葡萄糖分子中2位羟基被氨基取代后的GRAS级（通常认为安全的）单糖，具有治疗骨关节病、抑菌、抗衰老、保湿等功能，被广泛的用于食品、化妆品及医药保健品行业。我国是氨糖生产及出口大国，2013年氨糖出口额已经达到1.2亿美元。随着运动人群数量激增、人口老龄化的加剧，全球氨糖的需求量将持续上升。氨糖主要通过甲壳素水解法生产，虾蟹壳经酸水解、碱脱蛋白（>160℃）等步骤生成甲壳素，在经浓盐酸水解生成氨糖。该方法环境污染严重、易造成过敏反应、受原料来源限制。以甲壳素为底物的酶水解法，反应条件温和，但受限于多酶协同催化、产物抑制，产品得率和生产强度较低。微生物发酵法是新兴氨糖生产方法，但是菌株代谢改造困难、产物理论得率较低、产物为乙酰氨糖，还需要额外的酶水解或酸解过程将乙酰氨糖转化为氨糖。因此，亟待开发一种低成本、低污染、可持续的氨糖生产新方法。
体外多酶系统是模仿体内代谢途径，在体外组合一系列酶及辅酶构建复杂的生化反应网络，催化底物生成产物的新型生物制造平台。该体外生物合成途径可操作性强，产品得率高，反应速度快，已经被成功的利用到生产氢气、生物电、稀少糖等领域。基于氨糖现有生产技术面临的问题，游淳研究员带领的研究团队设想是否能够通过体外多酶体系，设计新型体外多酶代谢途径，实现氨糖的绿色高效生物制造。为此，他们设计了包含五个核心酶的体外多酶体系，用于催化淀粉和无机氨生产氨糖。通过酶元件挖掘、计算模拟（proof-of-concept assay）、反应条件优化以及反应体系放大，游淳研究组展示了一个具有光明工业应用前景的新型氨糖生物制造平台。最终结果发表在催化领域顶级期刊ACS Catal.上。中国科学院天津工业生物技术研究所孟冬冬副研究员为论文第一作者，游淳研究员为通讯作者。
该体外多酶体系通过五个核心酶催化淀粉和无机氨生成氨糖。α-葡聚糖磷酸化酶（alpha-glucan phosphorylase，αGP）在无机磷存在下催化淀粉磷酸解，生成葡萄糖1-磷酸（G1P）；磷酸葡萄糖变位酶（phosphoglucomutase，PGM）催化G1P生成葡萄糖6-磷酸（G6P）；磷酸葡萄糖异构酶（phosphoglucose isomerase，PGI）催化G6P异构生成果糖6-磷酸（F6P）；氨糖6-磷酸脱氨酶（glucosamine 6-phosphate deaminase，GlmD）催化F6P和无机氨生成氨糖6-磷酸（GlcN6P）；氨糖6-磷酸脱磷酶（glucosamine 6-phosphate phosphtase，GlmP）催化GlcN6P脱磷生成终产物氨糖（图1A）。基于脱磷酶催化反应的不可逆性，该多酶级联催化路径具有负的吉布斯自由能，能够拉动整个反应向着生成产物的方向进行（图1B）。在数据库分析或文献检索的基础上，通过对得到的目标酶进行详细的酶学性质鉴定，挑选出酶活高、反应条件一致、能够大量表达的目标酶（图1C）。在本研究中，挖掘底物特异性高的脱磷酶是决定该反应体系底物转化率的重要因素。▲图1. 设计产氨糖体外多酶体系。（A）催化淀粉和无机氨转化为氨糖的体外多酶催化路径。（B）在pH值为7.5、离子强度为0.1 M的条件下，各反应步骤的标准吉布斯自由能变化。（C）重组蛋白的SDS-PAGE分析。泳道M，蛋白质marker。αGP：α-葡聚糖磷酸化酶；PGM：磷酸葡萄糖变位酶；PGI：磷酸葡萄糖异构酶；GlmD：氨糖6-磷酸脱氨酶；GlmP：氨糖6-磷酸脱磷酶；(Glc)n和(Glc)n-1：淀粉；G1P：葡萄糖1-磷酸；G6P：葡萄糖6-磷酸；F6P：果糖6-磷酸；GlcN6P：氨糖6-磷酸；Pi：无机磷；GlcN：氨糖z。
在上述研究基础上，作者首先通过计算模拟验证该体外多酶体系是否能够催化淀粉和无机氨生成氨糖。将纯化获得的酶与底物、离子、缓冲液混合，通过高效液相色谱分析反应液中氨糖含量（图2），结果显示所构建的体外多酶反应体系催化淀粉成功生成氨糖，氨糖产量在反应10 h达到3.88 g/L，底物摩尔转化率36.3%。对反应体系中其他组分进行测定，结果显示G6P是反应液中积累的主要代谢中间产物，葡萄糖是重要的代谢副产物。考虑到计算模拟中低的底物转化率，作者对反应体系的初始pH、五个核心酶添加量、镁离子浓度和铵盐浓度进行了优化。在最优反应条件下，反应20 h时，催化10 g/L淀粉生成7.2 g/L氨糖，底物摩尔转化率69.1%。因为αGP不能利用淀粉分支处的葡萄糖单元，在本研究中，作者通过异淀粉酶（isoamylase，IA）切断淀粉中的α-1,6糖苷键，生成直链麦芽糊精，从而提高底物利用率。之后，αGP磷酸解麦芽糊精末端葡萄糖单元生成G1P，直到剩余的底物为麦芽二糖/麦芽三糖。为了提高剩余底物（麦芽二糖/麦芽三糖）到氨糖的转化，作者向反应体系中添加4-α-葡聚糖转移酶（4-α-glucanotransferase，4GT）用于将麦芽二糖和麦芽三糖生成更长聚合度麦芽糊精从而能够继续被αGP利用。在本研究中，在向反应体系中添加4GT后，反应20 h时，催化10 g/L淀粉生成7.91 g/L氨糖，底物摩尔转化率75.8%。▲图2. 催化麦芽糊精和无机氨生成氨糖的概念试验。反应在以下条件下进行：100 mM HEPES缓冲液（pH 7.0）、5 mM MgSO4、100 mM（NH4）2SO4、10 g/L IA处理的麦芽糊精、10 mM磷酸盐、1 U/mL αGP、1 U/mL PGM、1 U/mL PGI、1 U/mL GlmD和1 U/mL GlmP。（A）计算模拟的HPLC图谱。（B）保留时间为9.5 min至10.2 min时，反应液中氨糖的HPLC峰图。（C）底物、中间产物和产物的时间进程曲线。
体外多酶体系的放大生产与化学工业的放大生产相似，小体积的体外多酶生物系统的性能通常与大体积时候相同，这一体系放大容易的特性有利于体外多酶体系的产业化。在本研究中，作者测试了高底物浓度（50 g/L淀粉）下氨糖的生产情况。如图3所示，反应30 h时，催化50 g/L淀粉生成23.7 g/L氨糖，底物摩尔转化率47.7%。向反应体系中添加4GT后，淀粉到氨糖的摩尔转化率提高到51.1%。▲图3. 体外多酶体系催化高浓度底物合成氨糖。反应在50 g/L经IA处理的麦芽糊精（277.5 mM葡萄糖当量）、200 mM HEPES缓冲液（pH 7.5）、5 mM MgSO4、20 mM磷酸盐、500 mM（NH4）2SO4、10 U/mL αGP、10 U/mL PGM、15 U/mL PGI、10 U/mL GlmD和10 U/mL GlmP的条件下进行。
综上所述，我们成功地构建了一个新的生物炼制平台，通过体外多酶体系用于催化淀粉和无机氨生成氨糖。通过反应条件优化，催化10 g/L麦芽糊精生产氨糖的摩尔转化率达到75.8%，催化50 g/L麦芽糊精的氨糖得率达到23.7 g/L。在未来的工作中，我们将会在挖掘GlcN6P特异性脱磷酶、阐明GlmP的底物特异性机制、建立耐热氨糖体外多酶体系、抑制氨糖降解等方面开展深入研究。虽然仍有进一步改进的空间，但本研究开发的体外多酶体系已经显示出它作为一种安全、可持续、绿色的氨糖工业生产替代方法的巨大潜力。游淳，研究员，博士生导师。2010年博士毕业于复旦大学，随后在美国弗吉尼亚理工大学从事博士后研究。2016年加入中国科学院天津工业生物技术研究所任研究员、体外合成生物学中心主任。已先后在ACS Catal.、PNAS、Angewandte Chemie International Edition、Biotech. Bioeng.、Biotech. Biofuels、Appl. Environ. Microbiol.等重要学术期刊上发表40余篇SCI论文，申请20多项国内专利和2项PCT专利，并且与国内多家企业建立合作关系。目前实验室正在招收博士后或科研助理，欢迎相关专业（分子生物学，酶工程，代谢工程）的优秀人才加入团队。游淳研究员带领的研究团队主要开展体外合成生物学的研究，围绕体外生物合成系统组装的适配性、稳定性、有效性等关键科学问题，构建超稳酶元件库，阐明人工设计途径中酶元件的结构与功能关系，创建非天然生物酶，为体外生物合成途径提供特制元件；解析酶元件和人工辅酶识别的分子机制，创制人工辅酶介导的非天然功能模块；揭示多酶复合体物质与能量流传递及分配调控机制，建立多酶复合体的人工设计原则方法；建立非细胞合成途径的工业测试与调控技术，形成人工非细胞合成体系设计与调控标准与原则，为体外生物合成体系设计与定向改造提供理论指导；实现高附加值化学品生成路线的替代，降低高值化学品生成成本。
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American Journal of Cancer Research 5, 2929 2943 2015 buy cialis online india