合成多肽药物质控及杂质谱研究

胡玉玺¹ 蒋煜¹ 韩天娇² 何驰宇¹

(1 国家食品药品监督管理总局药品审评中心,北京100038；2国家食品药品监督管理总局食品药品审核查验中心,北京100061)

[摘要] 本文主要以相关指导原则和电子刊物为基础，探讨合成多肽药质量控制项目设置的合理性，同时对多肽药物杂质谱研究应关注的内容进行分析。

[关键词] 合成多肽药；质量标准；杂质谱

[中图分类号] R95 [文献标志码] C [文章编号]1003-3734（2018）05-0502-07

Study on quality control and related substances of synthetic peptide drugs

Hu Yuxi1   Jiang Yu1   Han Tianjiao2

(1 Center for Drug Evaluation, China Food and Drug Administration, Beijing 100038, China；2 Center for Food and Drug Inspection, China Food and Drug Administration, Beijing 100061, China)

[abstract] Referencing to relevant guidelines and electronic journals, this paper mainly discusses the scientific justification of specifications of synthetic peptide drugs，as well as the impurity analysis during synthetic peptide development. 

[Key words] synthetic peptide drugs；quality standard；related substances

[概述] 合成多肽药物可视为界于有机小分子和蛋白质大分子之间的一类特殊药物。在《制备工艺和过程控制对合成多肽药物有关物质的影响》[1]中已对合成多肽药物制备工艺部分进行了论述，本文主要就合成多肽药物质控项目设置的合理性和杂质谱研究的全面性进行探讨。

合成多肽作为一类特殊的药物，其氨基酸序列，潜在的二级和三级结构，以及制备工艺和质控要求等，与经典小分子化学药物相比有明显差别，具有多样性和复杂性，也可能是这个原因，国内外指导文件很少涉及此类品种。FDA于1994年发布了“Guidance for Industry for the Submission of Chemistry，Manufacturing，and Controls Information for Synthetic Peptide Substances” [2]，国家食品药品监督管理总局于2007年发布了“合成多肽药物药学研究技术指导原则”[3]，两个指导原则对合成多肽药物的制备工艺、结构确证、质量研究与质量标准和稳定性研究等方面提出了相应的技术要求，在当时对多肽药物的研究和开发起到了积极的指导作用。但随着药品开发和质控理念的提升，未见国内外相关技术指导原则进行相应更新。如何结合最新药品研发理念，合理的开发并控制多肽类药物的质量具有重要意义。

目前，国内外药典收载了十几个合成多肽药物，质量标准中规定的控制项目主要包括：外观、比旋度、鉴别、酸度、溶液澄清度与颜色、氨基酸组成、残留溶剂（醋酸、三氟乙酸）、水分、有关物质、微生物限度、含量等。美国药典委员会多肽专家小组于2014年发表了相关文章论述了多肽药物质控标准及相应分析方法，见表1[4]。质控项目中氨基酸序列、肽谱、氨基酸组成等为多肽类药物特有质控项目，也是多肽药物的常规检查项目。与经典小分子化药相比，合成多肽药物在鉴别和有关物质检查项目存在一定特殊性。

表1 多肽药物的质量控制项目和分析方法

a:批次放行时需要检测的项目；HPLC:高效液相色谱法；MS:质谱；NMR:核磁共振;FTIR:傅里叶变换红外光谱

药典收载的合成多肽类原料药鉴别项目多为以下方法：高效液相法（HPLC法，色谱条件与含量测定项下方法相同）、红外法、双缩脲显色反应等，对于多肽类药物来说，上述鉴别项目专属性较差，需考虑增加专属性更强的检测手段进行鉴别考察，如肽谱、核磁或质谱等鉴别方法。如现行版美国药典中，收载的去氨加压素原料药，鉴别项目采用质谱检测；现行版欧洲药典中，收载的布舍瑞林和戈舍瑞林原料药鉴别项目采用核磁检测。采用质谱法鉴别时，其结果应在理论值的±1.0质量单位内。

核磁共振光谱鉴别适用于氨基酸数目较少的多肽药物，对于超过10个氨基酸残基的多肽，核磁共振光谱数据分析会受到一定的挑战，可以选择使用肽谱进行鉴别研究。

美国药典委员会多肽专家小组建议如选择HPLC定位方法作为鉴别方法，应对样品和标准品主峰的保留时间进行比较，并要求标准品和样品等剂量混合进样时，能得到单峰。

合成多肽药物的杂质谱复杂，包含由起始物料引入的杂质、工艺相关的杂质和降解产生的杂质等，为实现有效检出各潜在杂质，通常需要采用多种不同原理的检测方法如反相HPLC法，离子交换HPLC法，分子排阻HPLC法等。如某进口39肽药物，原料药中控手段采用反相HPLC法控制13个已知杂质，最大未知单个杂质和总杂质，离子交换HPLC法控制2个特定杂质，分子排阻HPLC法控制二聚体等聚合物杂质。

现行版欧洲药典通则中提出的多肽原料药杂质限度要求比ICH Q3A指导原则的要求更宽泛，报告阈值、鉴定阈值和界定阈值分别为0.1%、0.5%和1.0%[5]，主要依据可能是与传统小分子药物的杂质相比，多肽类杂质引发毒理学问题的风险较低。美国药典委员会多肽专家小组对多肽药物的杂质限度存在其他要求，认为不同的多肽药物的活性存在较大差异，不同的杂质可能同样存在活性的差别，同时多肽类药物多为注射剂，风险相对较高。因此，该小组认为多肽药物杂质控制限度的制定应该结合特定品种进行具体分析。

如《制备工艺和过程控制对合成多肽药物有关物质的影响》[1]所述，多肽药物杂质谱复杂，应结合起始物料情况、制备工艺和稳定性考察结果对多肽药物进行系统的杂质谱分析。目前，国内申请人向CFDA递交的合成多肽药物杂质谱研究资料要么不够充分，考察杂质较少，未对由起始物料引入的杂质、工艺杂质和降解杂质等进行系统的考察；要么考察数十个杂质，堆积“庞大”的杂质谱研究资料，将合成、降解引入的杂质与其他杂质混为一体，缺乏针对性分析和研究。以某28肽药物为例，共考察了65个潜在杂质，所研究的杂质谱中有23个缺失10至16个氨基酸残基的缺失肽杂质，暂且不考虑上述杂质在氨基酸偶联过程中生成的可能性，该产品制备工艺最后精制过程中有柱层析提纯步骤，缺失氨基酸数目较多的缺失肽杂质性质与目标多肽性质相差较大，即使在氨基酸偶联过程中能产生上述杂质，在柱层析过程中也能有效除去，引入终产品的可能性很小，提供的终产品检测报告中也证明了上述杂质在终产品中均不存在。另外，本品杂质谱研究中，对潜在易水解和易消旋的氨基酸引入的杂质均未进行针对性研究，因此尽管考察杂质数量很多，杂质谱研究仍存在较大缺陷。综上，对组成氨基酸的性质、整个制备过程和潜在的降解途径的理解，对合成多肽的杂质谱研究尤为重要。

美国药典委员会多肽专家小组发表的文章中，涉及了合成多肽药物杂质谱研究内容和考察方法，见表2和表3[3]。《制备工艺和过程控制对合成多肽药物有关物质的影响》一文中也对可能由起始物料和制备过程中引入的缺失肽、错结肽等杂质进行了讨论[1]。本文主要针对差向肽杂质、链端杂质、侧链杂质、氧化杂质等进行讨论。

表2多肽药物合成过程中产生的杂质

表3 多肽药物潜在的降解杂质

差向肽杂质为氨基酸序列中含一个或多个非预期手性构型的氨基酸残基所形成的肽链，差向肽杂质可能形成于原料氨基酸中的光学异构体，因此需要对原料进行严格控制；也可能形成于肽链合成过程中差向异构化。目前已知的差向异构化机理包括：直接烯醇化和生成恶唑酮（氮杂内酯）。机理见图1。在Fmoc保护策略的固相合成工艺中，由于避免了活化肽链端羧基，差向肽主要形成机理为氨基酸偶联过程中直接烯醇化，在氨基酸偶联过程中所使用的催化剂等碱性试剂具有催化脱氢作用，形成碳负离子，而部分氨基酸的侧链基团具有稳定该碳负离子的作用，因此在偶联过程中易产生相应的差向肽杂质，如半胱氨酸（Cys）,组氨酸（His）。 

图1 差向肽杂质形成机理

相对于其他类型杂质来说，差向肽杂质鉴定和分离均有较大难度。尤其对于含有氨基酸数目较多的多肽药物，对每一个手性氨基酸均利用合成相应的差向肽杂质对照品，使用HPLC出峰时间对比鉴定的方法工作量巨大。可采用氯化氘[DCl] /氘代水[D2O]水解衍生后，采用手性气相色谱-质谱（GC-MS）来测定每个氨基酸手性异构体的含量，鉴别出易产生消旋的氨基酸，进一步制备出相应的差向肽杂质对照品进行HPLC出峰时间对比鉴定，证明拟定分析方法可以有效检出易产生的差向肽杂质。

链末端杂质包括两大类：一类是N端酰化或C端脱酰胺化产生的杂质，该类杂质较易得到杂质对照品，研究难度不大。另一类杂质是由链末端活性基团“反咬”所形成的杂质，如N端的氮原子对第2个与第3个氨基酸残基之间酰胺键中的羰基发生亲核进攻，随后导致上述两个氨基酸残基发生截断，生成二酮哌嗪类物质，肽链生成少两个氨基酸的缺失肽杂质。当N端为位阻较小的脯氨酸，甘氨酸残基时，有利于上述副反应的发生。另一方面，如N端氨基酸残基为谷氨酰胺时，则焦谷氨酸生成反应可能性很大。与上述反应机理类似，即N端氮原子进攻谷氨酰胺侧链羰基碳后生成焦谷氨酸多肽类似物。N端残基为天冬酰胺时也可发生这一转化过程。

图2 二酮哌嗪和焦谷氨酸降解机理

侧链杂质主要可分为2类：侧链保护基团引入的杂质和氨基酸侧链本身具有反应活性引入的杂质。在多肽合成过程中，侧链保护基团在酸解脱除过程中，可能存在脱除不完全，同时形成的碳正离子可能与肽链中潜在的亲核位点偶联，形成其他杂质。此类杂质一般会表现出与目标多肽分子量、极性等方面的差异，采用适当的手段可以充分说明。

由氨基酸侧链本身具有反应活性引入的杂质的分析需建立在对所组成氨基酸性质充分理解的基础上，较常见的是由谷氨酰胺、天冬酰胺侧链酰胺键水解产生的降解杂质。上述氨基酸可以进一步发生如下副反应，由天冬酰胺水解产生的天冬氨酸，或多肽序列中含有的天冬氨酸，则易生成琥珀酰亚胺结构，通过C端酰胺基氮原子对天冬酰胺或天冬氨酸残基的γ-羰基发生亲核进攻，形成五元琥珀酰亚胺环的反应。弱酸性条件有利于上述成环反应，生成的环状结构在生理条件和碱性条件下均不稳定，可发生消旋化。琥珀酰亚胺环的消旋化和水解可生成由L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-异天冬氨酸和D-异天冬氨酸组成的混合物，因此可使原天冬酰胺残基发生脱酰胺基化和消旋化，或可使原天冬氨酸残基发生异构化和消旋化生成系列杂质。如肽链中含有谷氨酰胺或谷氨酸时，也可发生类似的副反应。 

图3 琥珀酰亚胺降解机理

精氨酸侧链可以发生氨基化，反应生成一级胺，转化为鸟氨酸残基的副反应。该鸟氨酸残基含一个未受保护的氨基，因此可与其他氨基酸残基发生偶联，进一步生成其他的杂质。

半胱氨酸中碳硫键在氢氧根离子催化下可发生β-消除的副反应，该副反应将生成两种新残基（即脱氢丙氨酸残基和硫代半胱氨酸残基）。脱氢丙氨酸可与合成体系中含有的赖氨酸或其他含有活性氨基化合物反应，发生赖氨酸-丙氨酸交联，生成聚集体杂质，硫代半胱氨酸则可进一步降解为含巯基的产物，相关降解途径可参见图4。丝氨酸和苏氨酸残基也可能发生β-消除副反应。

图4β-消除降解机理

固相合成过程中，特定氨基酸残基可能发生氧化或还原反应。已在卡贝缩宫素和依来多辛中分别发现了因半胱氨酸和甲硫氨酸残基氧化而形成的杂质。上述杂质相对于目标序列多肽的质量差异为16、32和48 Da，为不同氧化阶段产生的杂质，即亚砜、砜和磺酸。组氨酸和赖氨酸也易发生氧化，分别生成2-氧代-组氨酸和氨基己二酸，贮存过程中长时间光照或暴露在空气中均可导致生成该氧化杂质。此外，色氨酸侧链在酸性条件下的反应活性较高，可发生氧化生成系列杂质，还可发生还原反应。易发生氧化和还原的氨基酸残基的总结情况可参见图5。

图5  氨基酸氧化/还原相关杂质。

多肽药物在纯化和放置过程中，由于端基具有反应活性或二硫键的改变等，可能生成一定量的多聚体杂质。如去氨加压素中，发现并鉴定出的多聚体杂质有6种之多。多聚体杂质一般可使用分子排阻色谱法进行有效的检测。

[小结] 合成多肽药物的开发需要建立在对多肽药物充分理解的基础上，建立全面的质控策略；杂质谱研究应对起始物料引入的杂质、制备工艺中生成的杂质、降解过程产生的杂质进行充分考察，保证杂质谱研究的全面性。

参考文献：

[1] 胡玉玺，蒋煜，韩天骄. 制备工艺和过程控制对合成多肽药物有关物质的影响[J].中国新药杂志，2017,26（18）：2143-2148.

[2] U.S. FDA Guidance for Industry for the Submission of Chemistry，Manufacturing，and Controls Information for Synthetic Peptide Substances[S].1994.

[3] 国家食品药品监督管理总局. 合成多肽药物药学研究技术指导原则[S].2007.

[4] EGGEN I. Control strategies for synthetic therapeutic peptide APIs Part I:analytical considerations[J]. Pharma Technol, 2014,27(3):16-21.

[5] Ph. Eur., General Guidance 2034, Substances for Pharmaceutical Use[S].2015.