YcaO是最初注释为DUF181的一个未知功能的结构域，常见于许多细菌来源的RiPPs天然产物的生物合成过程中。随着RiPPs生物合成过程的研究及酶的生化研究，YcaO蛋白的功能逐渐被研究出来。目前被证实的功能主要是负责形成thiazoline, oxazoline和 methyloxazoline五元氮杂环，这一过程起始于L-Cys、L-Ser或L-Thr亲核侧链对羰基的进攻，接着在ATP的作用下中间体进行磷酸化，磷酸基团离去后形成脱一分子水的azolines杂环。在FMN依赖的脱氢酶作用下，azolines可被继续氧化产生azoles (Figure 1A)。许多RiPPs中都含有azoles杂环，如LAPs (linearazole-containing peptides), cyanobactins 和thiopeptide antibiotics等。

Thiopeptide antibiotics是一类富含硫原子且结构高度修饰的RiPPs，大环系统含有一个含氮的中心结构，还含有多个azol(in)es及脱水氨基酸 (Figure 1B)。它们普遍具有良好的生物活性，尤其是对多种耐药性病原菌具有显著的抑制活性，因此被广泛地研究。环系不同的硫肽抑制细菌蛋白质合成的机制也尽不相同。如29元环系的GE2270A、GE37468和thiomuracin A通过与延伸因子Tu的作用阻断其与核糖体的结合，从而发挥活性；而26元环系的thiocillins、thiostrepton 和nosiheptide靶定于50S核糖体大亚基，结合在L11蛋白和23S RNA之间的区域，从而阻断转录因子的结合。35元环系的sulfomycins、berninamycin和TP-1161抗菌机制与26元环硫肽相似，但是其具体的作用方式仍是不清楚的。35元环硫肽是目前发现的最大环系的RiPPs，其生物合成过程尚不清楚，因此中国科学院上海有机化学研究所的刘文团队围绕sulfomycins展开了研究。

首先，为了鉴定sulfomycins的生物合成基因簇，作者将已被报道的环化脱水酶扩增引物作为简并引物对Streptomyces viridochromogene ATCC 29776进行了PCR，成功扩增出一条约0.75kb的DNA片段 (P_sul)。基于P_sul的同源重组对该基因区域进行了失活，导致sulfomycins完全不再产生，因此证实了P_sul所在基因与其生物合成相关。接着作者构建了S.  viridochromogene的cosmid文库，并以P_sul为探针进行了筛选，成功鉴定到几个重叠的cosmids。对pSL5001进行了测序，其大小约为38.5kb，共含有26个orfs。序列分析表明其中16个orfs (15个结构基因，1个自抗性基因)组成了sulfomycins的生物合成基因簇 (Figure 2A)。

类似于其他已被研究的硫肽，S.  viridochromogene利用多个普遍存在的后修饰酶对前体肽SulA (54-aa)进行加工。SulA的核心序列包含17个氨基酸，且含有多个L-Ser、L-Thr和L-Cys残基 (i.e., SC²TTT⁵GC⁷TT⁹SSS¹²SSSSS)。后修饰过程起始于azoles的形成，推测是由sulBCDEFG六个基因编码的蛋白催化的。这些蛋白和已知的环化脱水酶和脱氢酶组分具有序列的相似性。产生的线性中间体1接着被sulHI编码的脱水酶以一种类似于LanB的机制催化Ser/Thr脱水形成双键；接着由sulJ编码的环化酶催化分子内的[4+2]环加成，关环形成35元环系，并产生中心的吡啶环。剩下的五个基因sulKLMNO可能参与了后续的后修饰过程，即脱水的L-Thr4衍生化产生γ-羟基化的C₅残基、C末端的胺化切割、L-Gly6的羟化及后续的O-甲基化过程。整个生物合成路径如Figure 2B所示。

六个基因sulBCDEFG参与形成了sulfomycins中五个唑环的形成，作者就这一过程展开了深入的研究。前期研究发现在26元和29元环硫肽生物合成过程中存在三个基因编码了一个双组分的环化脱水酶复合体和一个脱氢酶。其中催化形成azoline的环化脱水酶复合体包含以下两个组分：1) Ocin-ThiF like伴侣蛋白 (F蛋白)，其N端融合了一个保守的RRE结构域；2) 双结构域的蛋白，其YcaO结构域的N端融合了一个不同的E-like结构域，促进与F伴侣蛋白的整合，从未实现该蛋白对前体肽的催化作用。而sulB和sulC分别编码了一个F伴侣蛋白和一个双结构域的E1-YcaO蛋白，因此证实了经典的环化脱水酶复合体对sulfomycins的生物合成也是至关重要的。敲除sulC的突变菌株确实不再产生任何产物。剩余的四个基因在26元或29环硫肽的生物合成过程中不存在同源蛋白，其中sulD和sulE分别编码了单结构域的YcaO和E1-like蛋白，sulF和sulG编码的蛋白分别和经典的脱氢酶N端催化结构域和C端FMN结合结构域同源(Figure2C)。SulF包含三个结构域，即RRE结构域、E1-like结构域和氧化酶结构域，猜测其可能负责提供酶的催化活性并介导蛋白的整合。同样地，分别敲除sulE、sulF和sulG均不再产生sulfomycins，因此证实了这三个基因也参与了35元肽骨架的生物合成。

为了研究L-Cys2、L-Thr5、L-Cys7、L-Thr9和L-Ser12是按照怎样的顺序发生环化脱水和脱氢形成五个唑环的，作者在大肠杆菌中进行了一系列的异源表达实验。结果表明只有sulA与sulBCDEFG共表达时才能产生分子量减少100 Da (- 5 × [H₂O+2H]) 的含有5个唑环的产物1 (Figure 3)。为了进一步揭示每个蛋白的功能，作者对产生1的大肠杆菌表达系统进行了点突变实验。首先对两个YcaO相关蛋白保守的L-Glu残基进行了突变，得到了SulC^E370A和SulD^E199A突变体大肠杆菌 (Figure 3A)。结果表明这两种突变均丧失了1的产生能力，其中E370A突变体积累了未修饰的SulA，揭示了YcaO蛋白的活性对后修饰的起始是必须的。SulD的E199A突变菌新产生了线性中间体2 (- 20 Da, -1 × [H₂O+2H])和3 (- 40 Da, - 2 × [H₂O+2H])。通过HR-MS/MS对其结构进行分析，证实了2中只含有一个L-Cys2来源的thioazole单元，而3的结构中除了上述的thioazole单元，还存在一个额外的L-Thr9来源的methyloxazole。基于这些结果，作者猜测双结构域的E1-YcaO蛋白SulC负责第一阶段L-Cys2和L-Thr9的杂环化，而另外一个独立的YcaO蛋白SulD参与第二个阶段L-Thr5、L-Cys7和L-Ser12残基的杂环化过程。

接着在产生1的大肠杆菌系统中对两个脱氢酶进行了点突变(Figure 3B)。SulF^K472A和SulF^Y473A突变体均不再产生1，而是累积了中间体4 (- 18 Da, - 1× H₂O)和5 (- 36 Da, - 2 × H₂O)，猜测它们分别是2和3未氧化之前的底物。SulG^R62A突变体也是同样的结果，表明了azolines到azoles的脱氢过程需要依赖FMN，并且SulF和SulG组合参与了这一过程。

为了验证双结构域E1-YcaO蛋白SulC的功能，并揭示其杂环化的残基，作者在简化的大肠杆菌表达系统中将SulA与SulBC进行了共表达，成功地将前体肽转化为了中间体4和5 (Figure 3B)，证实了SulB和SulC相互作用形成了环化脱水酶异源二聚体，以此来催化形成azoline。MS/MS分析表明-18 Da的中间体4中含有一个来源于L-Cys2的thioazline单元，而-36 Da的中间体5由于结构不稳定并未分析出第二个杂环化的残基，但是其也包含一个L-Cys2杂环化形成的thioazline单元，表明L-Cys2确实为第一个发生杂环化的残基。碘乙酰胺衍生化实验表明5和4一样，产生了1个 + 57 Da的烷基化产物，表明5和4一样包含一个游离的巯基，也就说明SulA中L-Cys7在第一阶段是不发生反应的，含羟基侧链的L-Thr5、L-Thr9或L-Ser12可能是第二个被杂环化的残基。

为了研究不稳定的azoline中间体的结构，作者设计了4和5的体外转化实验。为了形成脱氢的azole中间体2和3，需要重构脱氢酶SulEF的活性，但是多次尝试均未得到可溶的SulE、 SulF或SulEF共表达蛋白。这一结果表明独立的E1-like蛋白SulE对1的产生的确是必不可缺的。共表达SulEFG时，成功得到了淡黄色的可溶蛋白，并证实该蛋白是一个结合了FMNH₂的三成分复合物，揭示了SulE、SulF和SulG之间存在特定的整合 (Figure 4A)。SulEFG可以将5成功地转化为-2 Da的di-azole中间体3，最终确定了5的结构中含有一个来源于L-Thr9的methyloxazoline单元 (Figure 4B)。因此证实了第二个发生杂环化的氨基酸为L-Thr9。

为了研究第二个阶段杂环化的残基，作者对另外一个独立的YcaO蛋白SulD的催化过程进行了研究。为了鉴定SulD发挥活性所需要的伴侣蛋白，分别将SulD、 F蛋白SulB和E1-like蛋白SulE在大肠杆菌中表达得到了纯化蛋白 (Figure 5A)。SulB或SulE与SulD共孵育均不能转化di-azole的中间体3，表明SulD的作用方式不同于第一阶段的E1-YcaO蛋白SulC。确实，当SulD与完整的SulEFG复合体共孵育时3转化形成了penta-azole产物1，伴随着tria-zole中间体6 (- 60 Da, - 3 × [H₂O+2H]) and tetra-azole中间体7 (- 80 Da, - 4 × [H₂O+2H]) 的产生。HR-MS/MS证实了6中包含第三个来源于L-Cys7的thioazole单元，7中包含第四个来源于L-Thr5的methyloxazole单元。这些结果表明SulD通过与脱氢酶复合体SulEFG的相互作用，在第二阶段连续催化L-Cys7、L-Thr5和L-Ser12形成唑环。

第二阶段环化脱水酶SulD与脱氢酶复合体SulEFG的相互作用是前所未见的。作者通过等温滴定量热法证实了这一相互作用 (Figure 5B)。在L-Cys7、L-Thr5、和L-Ser12转化形成唑环的过程中，SulE作为一个独特的伴侣蛋白发挥了双重功能：SulE作为E1-like蛋白与脱氢酶SulFG形成异源三聚体，这是通过与SulF中心的E1-like结构域的相互作用实现的；通过SulE的整合，SulF上的RRE结构域可以进一步促进SulD的环化脱水酶活性 (Figure 6A)。

总结来说，作者通过体内的异源表达及体外转化实验揭示了35元硫肽sulfomycins的生物合成过程(Figure 6B)。其合成分为两个阶段：第一阶段由双结构域的E1-YcaO蛋白SulC催化，在典型的环化脱水酶二聚体SulBC的作用下依次催化L-Cys2和L-Thr9形成di-azoline中间体5，接着在脱氢酶复合物SulEFG的作用下氧化产生di-azole中间体3；第二阶段SulEFG通过与独立的YcaO蛋白SulD的整合形成异源四聚体，依次催化L-Cys7、L-Thr5、和L-Ser12的杂环化产生其他三个唑环。在SulDEFG的催化过程中并未检测到任何azoline中间体，进一步揭示了SulD与SulEFG复合体的紧密结合。这样的方式在26元和29元环系的硫肽合成过程中是从未发现的。作者通过基因挖掘的手段证实了SulDEFG四个蛋白在35元硫肽抗生素的产生菌株中是普遍存在的。这一发现为研究含唑环的不同RiPPs的生物合成过程提供了理论依据，为促进合成生物学生产新型硫肽抗生素奠定了基础。

整理：Liu CL

全文链接：

https://doi.org/10.1021/jacs.0c02329

文章题目：

AHeterotrimeric Dehydrogenase Complex Functions with Two Distinct YcaO Proteinsto Install the Five Azole Heterocycles in
the Thirty Five-Membered Thiopeptide Antibiotics Sulfomycins