1.趣谈氮元素

氮元素最外层有5个电子，3个成单电子和一对孤电子对。不同于碳的最外层就4个成单电子，成键后就没有多余的了，就只能老老实实的呆着，比如甲烷CH4人生已经圆满，不会有再给出电子和获得电子的动力。氮元素的3个成单电子成键后，多出了一对孤电子对，氮只有7个质子，无法紧紧抓住围绕着它们的所有10个电子的心。

这一对孤电子对不是安分的主，只要环境不是把它们抓的很紧，以NH3为例，碰到有空轨道的，比如可怜兮兮的没有任何电子只有空轨道的氢离子H+,它们就黏糊上去了，于是有了NH4+。如果NH3其中的一个或者以上的氢换成有机基团，就是本文需要讨论的有机胺类化合物。氮元素中那一对不安分的孤电子对，也造就了我们HPLC方法开发最常见的让人痛苦不堪的碱性有机化合物。

2.有机胺分类

本文中对有机胺分类是为了指导HPLC方法开发，将有机胺类化合物分为3类：碱性化合物、中性化合物和酸性化合物。看到这些分类可能有些读者会很疑惑，有机胺类还会有酸性化合物？N这个家伙没什么节操的，看它所在的环境，如果连接它的都是给电子基团，如三乙胺，N连着三个慷慨的好给电子的乙基，那它的那一对不安分的孤电子对就要到处浪，于是就成了路易斯碱。

如果连接它的是吸电子基团，比如羰基，化合物对电子的约束增强，它们就会安分很多，即碱性减弱，如果连接的吸电子基团继续增多或者增强，N上的电子被被这些强盗抢走了，那么它甚至不但不会有多余的电子出去浪，它还要抢别人的电子，即华丽变身为路易斯酸。比如邻苯二甲酰亚胺，它N上的氢有很强的电离倾向，化合物显酸性。结构式如下图：

有机胺类化合物呈中性的状态，可以理解为N上连着吸电子基团，强度刚好满足约束N上的多余的想要出去浪的电子，于是N即没有给电子的倾向，也没有获得电子的倾向。当然需要说明的是这是一个区间，在这个区间内有机胺类化合物电离倾向非常弱，我们可以认为是中性化合物，例如苯并嘧啶。

3.如何判断基团是吸电子还是给电子？

将基团加上一个氢原子（-H）或者羟基（-OH）使之构成一个中心元素的化合价为常用的分子，如此以来，分子呈中性，氢原子显正电，羟基显负电，剩下的基团所表现出的电性就可以判断了。如：甲基(CH3)，用还原法给它加上一个氢原子(-H)将其还原为甲烷，因为我们知道甲烷是一个分子，呈电中性，而氢原子电负性很低，通常与其他基团结合时都显正电场，故此甲基就应该显负电场，根据上面的定义可知甲基为供电基团。

再如：硝基(NO2)，用还原法给它加上一个羟基(-OH)使之构成硝酸分子(HNO3)，因羟基显负电，故硝基显正电，根据上述定义可知硝基为吸电子基团。

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常见吸电子基团

硝基（-NO2）、三卤甲基（-CX3）X=F、Cl、氰基（-CN）、磺酸基（-SO3H）、甲酰基（-CHO）、酰基（-COR）、羧基（-COOH）。在有机胺类化合物中不饱和建可以和N的孤电子对形成p-π共轭效应，也表现出吸电子基团的现象，如苯胺的碱性弱于氨水，就是因为N上的孤电子对跑到苯的大π键上去浪了，整个化合物给电子的倾向减弱。

• 常见给电子基团

  
  

二烷基氨基（-NR2）、烷基氨基（-NHR）、氨基（-NH2）、羟基（-OH）、烷氧基（-OR）、酰胺基（-NHCOR）、酰氧基（-OCOR）、烷基（-R）、羧基甲基（-CH2COOH）。

4.HPLC方法开发

（1）概述

根据上文的内容，我们已经知道有机胺类化合物并不是都显碱性，有可能是中性也可能显酸性，需要根据结构式进行综合判断其性质并拟定适合的色谱条件。下文将有机胺类化合物分为中性、酸性、碱性三类分别阐述其方法开发注意的要点，需要澄清的是下文的内容是围绕该化合物进行讨论，不关注其含有的杂质情况，实际工作中如需要考虑相应杂质也可参考下文的思路。

（2）中性有机胺类化合物

该类化合物的HPLC方法开发和普通中性有机物并无区别，因其电离倾向很弱，所以无需使用缓冲盐，流动相用水-有机相系统即可，色谱柱可以根据保留情况用C18或者C8。

（3）酸性有机胺类化合物

该类化合物因具有较强的电离倾向，需要使用缓冲盐，缓冲盐的使用相关思路参见相关阅读里的《方法开发缓冲盐选择指南》。一般来说酸性化合物对缓冲盐的缓冲能力要求都不是太高，所以缓冲盐的浓度可以略低，如0.01-0.02mol/L，在特定情况下，缓冲盐的pH值也可以偏离pka±1的范围，如0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（不调节pH，约为4.6）。

缓冲盐的pH值需要偏离待测化合物pka±2的范围外，以获得较好的pH值耐用性，因此如果酸性有机胺类化合物酸性较弱，即pka较大（5以上）推荐使用较低pH值缓冲盐抑制其解离，如果使用高pH值缓冲盐，pH值需要在7以上，不利于色谱柱寿命。

如果酸性有机胺类化合物酸性较强，即pka较小（4以下）可能难以使用低pH值缓冲盐抑制其解离，如果极性较小可以尝试高pH值缓冲盐；但是一般这种情况该化合物极性都非常强，保留非常弱，使用高pH值很可能无法获得适当的保留时间，在这种情况可能需要用到离子对试剂如四丁基铵盐或者采用hillic、离子交换柱等方法。

（4）碱性有机胺类化合物

碱性有机胺类化合物是反相HPLC方法开发中最常见又最让人痛苦的一类化合物，有相关经历的读者应该立刻心领神会心有戚戚。最常见的是这类化合物的峰拖尾、很宽，然后和相邻峰分离非常差。所以该类化合物的HPLC方法开发是本文中重点阐述的内容。

首先要说明的是开发该类化合物反相HPLC方法所使用的色谱柱强烈建议使用封尾处理过的色谱柱，尽量选择封尾处理比较好的品牌与型号。一般来说，说明书上说明了采用二次封尾或者三次封尾的色谱柱，在碱性化合物峰拖尾上表现较好。

同上文的酸性有机胺类化合物，碱性有机胺类化合物因具有较强的电离倾向，需要使用缓冲盐。碱性化合物对缓冲盐的缓冲能力要求较高，一般来说缓冲盐浓度建议0.02mol/L以上。

缓冲盐的pH值需要偏离待测化合物pka±2的范围外，以获得较好的pH值耐用性，因此如果碱性有机胺类化合物碱性较弱，即pka较小（4以下）推荐使用较高pH值缓冲盐抑制其解离，如果使用低pH值缓冲盐，pH值需要在2以下，不利于色谱柱寿命。

如果碱性有机胺类化合物碱性较强，即pka较大（5以上）可能难以使用高pH值缓冲盐抑制其解离；一般这种情况该化合物极性都非常强，保留非常弱，使用低pH值很可能无法获得适当的保留时间，在这种情况可能需要用到离子对试剂如烷基磺酸钠或者采用hillic、离子交换柱等方法。

5.案例分析

（1）酸性有机胺类化合物

以上文提到的邻苯二甲酰亚胺为例，该化合物显酸性，应当使用缓冲盐，缓冲盐的pH值应当大于4，因该化合物具有酮式烯醇式互变情况，且以烯醇式为主，所以应当促进其电离，使该化合物互变平衡向烯醇式方向移动。可以选择的缓冲盐有磷酸盐、醋酸盐等。酮式烯醇式互变相关内容请见相关阅读《HPLC方法开发需注意的典型特殊结构化合物专题-酮式烯醇式互变》。

（2）碱性有机胺类化合物

以二甲双胍为例，2015年版中国药典中收载的盐酸二甲双胍原料药有关物质检测方法流动相为1.7 %磷酸二氢铵溶液（用磷酸调节p H 值至3.0)，色谱柱填充剂为磺酸基阳离子交换键合硅胶。

由于二甲双胍分子量小，且碱性非常强，因此无法用高pH值缓冲盐抑制其解离，在低pH值缓冲盐条件下保留太小，所以药典方法采用了离子交换柱。

盐酸二甲双胍肠溶胶囊采用的色谱条件又有些不同：“用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05%庚烷磺酸钠溶液（用10% 磷酸溶液调节pH值至4.0)-乙腈（84 : 16)为流动相”。该方法是在流动相中加入离子对试剂增强强电离组分的保留，为什么不与原料药一样也用离子交换柱呢？推测可能使辅料中有可溶的小极性组分污染离子交换柱。二甲双胍的结构式见下图：