受天然蛋白质组装体的酶活性调控作用所启发，作者通过基因工程改造非同源蛋白质SP1为硒酶，并将其与树枝状分子PAMAM组装成可控的纳米线，通过在反复可逆的组装与解离过程中控制催化位点的包埋与裸露，构筑一套由蛋白质组装行为调节的抗氧化体系，建立起可逆纳米结构与催化活性功能之间的桥梁。该体系的动态形貌与活性变化相对应，活性的阻断和恢复效率分别达到95.5％和98.7％，并且在多个开关循环后具有稳定的催化活力。本文为构建智能的人工抗氧化系统提供了一种实用的方法。

谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的抗氧化作用通常被认为是生物抵抗活性氧介导氧化损伤的重要防御手段。GPx包含稀有的氨基酸硒代半胱氨酸（Sec），通过消耗谷胱甘肽（GSH）可将过量的过氧化物还原为无害的羟基化合物。值得注意的是，催化位点周围的残基（例如Arg和Gln）通过静电相互作用和盐桥显着促进了GSH的特异性结合，从而提供了底物识别能力以确保GPx的高活性。由于天然GPx的高成本和较差的稳定性，有机小分子，超分子系统和天然蛋白都已被用作人工酶骨架来模拟抗氧化功能。相比于小分子，蛋白质具有更好的可塑性，能通过近似于天然酶的机制获得高催化活性。计算机辅助设计的兴起进一步推动了在非同源蛋白质上建立一个全新活性位点的尝试，该途经的重大优势之一是将抗氧化功能与蛋白质骨架的固有功能（例如热稳定性和变构调节）结合在一起，创造更丰富的可能性。

另一方面，活性氧不仅引起大分子损伤，而且起到关键信号分子的作用。活性氧的这种双重特性要求人工抗氧化酶必须以可控的方式维持稳定的氧化还原环境。近年来，刺激响应性材料被广泛应用与设计人工智能催化剂来模仿生命系统，这种材料因为可以通过响应外部刺激而改变其结构和性质而受到关注。在自然界中，蛋白质组装体的这种动态特征不仅能控制细胞结构，而且还在复杂生物功能的控制中起到关键作用。例如，天然酶亚基的解离和组装在酶活性的调节中起着至关重要的作用，这种组装与解组装的控制机制提供了研究构建人工可控智能酶的重要途径。

目前，随着超分子化学和蛋白质工程技术的发展，各种工具（例如金属配位，静电相互作用，主客体相互作用等）被用于构建蛋白质组装体。多层次蛋白质组装体已经被报导，例如一维纳米线，二维纳米片层和三维纳米笼等。蛋白质组装体被进一步赋予了精心设计的功能，包括光电传导和协同催化等。然而，如何构筑能将可逆形貌与可调控功能相协同的蛋白质组装体仍是现有技术的重大挑战。

既然蛋白质组装在分子水平上控制着生物行为的基本生命活动，必然可以作为含硒抗氧化系统设计的调控机制。首先通过计算机理性设计和基因工程改造非同源蛋白质SP1为硒酶，使其具有较强的抗氧化活性；并将含硒SP1与树枝状分子PAMAM组装成牢固可控的纳米线，在组装与解离状态下分别控制催化位点的包埋与裸露，从而实现该抗氧化系统的活力可控性质。该组装行为的驱动力为SP1蛋白与树枝状分子之间的静电作用力，可通过改变体系中离子强度的方法对组装驱动力进行调控，达到调控组装行为的目的。

在这项工作中，一种环状同源低聚蛋白SP1被选择作为含硒抗氧化酶的骨架。该蛋白的12个亚基通过疏水作用紧密结合在一起，形成两个堆叠的六聚环，盘面带有较强的负电性。在SP1盘的内圈引入了GPx活性位点，这样催化位点将在组装时被包埋在组装体内部，并在解离后暴露出来。通过调节离子强度以阻断或恢复SP1和PAMAM树枝状分子（PD5）之间的静电力，进行解离/组装之间的转化（图1A）。在这种情况下，蛋白质组装将有效地“打开”和“关闭”酶活性。结构分析表明，SP1蛋白与底物分子对接的特定空间位置有利于GSH的亲核攻击，并且预测的底物结合区表面富含正电荷残基（例如R4和K44），这可能有助于识别GSH的两个羧基GSH（图1B）。

由于带正电的氨基酸残基与GSH的羧基之间具有静电相互作用，我们构建了突变体模型SP1-E72R以提高底物结合亲和力（图1C）。催化活力测试显示，Seleno-SP1催化GSH还原H₂O₂的活性为117.2μmol·min^-1·μmol^-1，而未插入Sec的SP1蛋白则没有明显活性。该结果证实了人工抗氧化硒酶的成功构建，其活性比有机硒药物依布硒（ebselen）高118倍，并且其活性与人类血浆GPx的数量级相同。

▲图1. A) 蛋白质组装实现GPx催化活性的可逆开关；B) SP1蛋白上的GSH底物结合空腔；C) 分子对接的机制和GSH与相邻氨基酸残基之间的极性作用。

在测定Seleno-SP1的酶活性后，Seleno-SP1/PD5组装体的形貌在透射电镜（TEM）等多种分析方法中分别得到了表征，获得了有序的纳米线状结构（图2）。此外，在不同浓度的NaCl存在下，Seleno-SP1/PD5的电镜形态表明该纳米线仅在0.4 M NaCl的存在下发生解离，因为较高的离子强度这抵消了Seleno-SP1和PD5之间的静电力。此外,通过反复加入或去除NaCl，解离组装过程具有高度可逆性，这表明Seleno-SP1/PD5纳米线具有稳定的性质来承载动态催化功能。

▲图2. 存在0.1 M (A)，0.2 M (B)，0.3 M (C)，和0.4 M (D) NaCl的情况下，Seleno-SP1/PD5组装体的TEM图像。比例尺均为20 nm。

在此基础上，我们进一步测试Seleno-SP1/PD5系统的GPx活性是否能够对应其形貌变化（图3）。结果证明，Seleno-SP1/PD5组装体的活性有限，仅为5.3 μmol·min^-1·μmol^-1，阻断效率高达95.5％。剩余的活性是由于纳米线末端暴露的Sec和动态系统中的解离的Seleno-SP1。加入0.4 M NaCl后，活性达到115.7 μmol·min^-1·μmol^-1，与Seleno-SP1相比，恢复效率达到98.7％。在如此高的离子强度下，我们认为组装基元分子无法越过由分子间斥力在Debye长度上产生的能垒来获得静电相互作用，从而使纳米线在没有驱动力的情况下解离。该活性可以通过可逆的组装与解离过程以较低衰减率（<5％）反复打开和关闭多次，表明该抗氧化系

统具有较强的可逆性。

▲图3. A) 空白对照（黑色），Seleno-SP1/PD5组装体（蓝色）和含0.4 M NaCl的Seleno-SP1/PD5组装体（红色）的催化曲线；B) Seleno-SP1/PD5体系催化活性的反复可逆开关。

为了进一步了解Seleno-SP1/PD5的控制机制，该催化反应的表观动力学参数由Michaelis-Menten方程得出。Seleno-SP1的双倒数曲线产生了一系列平行线，揭示了典型的乒乓催化机理（图4）。Seleno-SP1的k_cat/K_m值达到3.21×10⁵ M^-1·min^-1，但是，Seleno-SP1/PD5组装体的k_cat/K_m值要低得多，为1.81×10⁴ M^-1·min^-1，与“关闭”状态下有限的催化活力一致。与Seleno-SP1相比，Seleno-SP1/PD5的K_m值增加了一个数量级。因为K_m值的增加表示该酶与底物的亲和力较弱，所以该结果证实了该酶与底物的结合被大大削弱，并提供了证据表明该组装过程将阻止GSH与活性位点的结合。

▲图4. Seleno-SP1催化GSH还原H₂O₂的双倒数曲线（[E₀] =酶的浓度）。A) 在[H₂O₂] = 0.4（▼），0.8（▲），1.6（●）和3.2 mM（■）时，[E₀]/V₀与1/[GSH] (mM^-1)的对应关系；B) 在[GSH] = 1.0（▼），2.0（▲），3.0（●）和4.0 mM（■）时[E₀]/V₀与1/[H₂O₂] (mM^-1)的对应关系。

最后，我们评估了Seleno-SP1/PD5对脂质的抗氧化作用（图5）。过量活性氧会严重损害生物大分子，产生脂质过氧化现象，并在氧化应激下导致线粒体膨胀。在该实验中，大豆卵磷脂和胆固醇被用于模拟细胞器的脂质成分，这些成分在ROS的存在下可以产生丙二醛（MDA）。然后，在不同的孵育时间后，通过紫外可见分光光度计在532 nm下用硫代巴比妥酸（TBA）确定MDA浓度，作为标记以量化ROS的生成量。添加Seleno-SP1/PD5组装体时，MDA的吸光度接近完全损伤组的吸光度。相反，具有0.4 M NaCl浓度的Seleno-SP1/PD5以浓度依赖的表现阻止了ROS的损伤作用。该结果表明，Seleno-SP1/PD5的抗氧化作用充分可控，显示出明显的抑制脂质过氧化作用的能力。

▲图5. A) 脂质过氧化测定的原理图示。MDA与TBA反应生成粉红色产物MDA-2-TBA，可以通过532 nm的紫外线检测到; B) 每组的紫外线吸收（532 nm）与孵育时间的关系。不含抗氧化剂的损伤对照组（■）；0.5 μM Seleno-SP1/PD5组装体（●）; 0.5 μM的Seleno-SP1/PD5组装体与0.4 M的NaCl（▲）; 1 μM的Seleno-SP1/PD5组装体与0.4 M的NaCl（▼）；2 μM的Seleno-SP1/PD5组装体与0.4 M的NaCl（◆）。

基于动态可控的蛋白质组装，一种可开关的含硒抗氧化系统Seleno-SP1/PD5被构建出来。该系统不仅显示出能与天然GPx竞争的高活性，而且还表现出离子强度响应的调节机制，因为离子强度对于Seleno-SP1和PD5之间的静电相互作用具有重大影响。该体系催化活性的阻断和恢复效率分别达到了95.5％和98.7％，并且这种开关效果可以持续多个循环，仅表现出非常有限的活力衰减。此外，Seleno-SP1/PD5与不同浓度NaCl的形貌表征证明，其催化活性的变化与可逆的组装与解组装行为高度对应。这项研究不仅为构建人工“智能”抗氧化体系提供了一新方法，还会建立起人工蛋白质组装体动态结构与可控功能之间的桥梁。

刘俊秋，杭州师范大学材料与化学化工学院教授, 博士生导师。教育部长江学者特聘教授，国家基金委杰出青年基金获得者。近年来在Chem. Review, Chem. Soc. Review，Acc. Chem. Res.，J. Am. Chem. Soc.，Angew. Chem. Int. Ed.等杂志已发表SCI研究论文150余篇。现任吉林省化学会理事。现任 General Chemistry、Polymer Sciences、高等学学校化学学报编委。课题组主要研究方向包括仿生化学、纳米生物材料、超分子仿酶等研究。