聚醚抗生素Tetronasin的诸多生物合成过程已经得到推测或阐明。然而其更为复杂的双环体系-环己烷与四氢吡喃的合成分子基础一直不为人知。本文作者通过一系列体内敲除、体外酶学实验验证了其基因簇中两个[4+2]环化酶Tsn11与Tsn15协同负责环己烷与四氢吡喃结构的生物合成过程：Tsn11介导了逆电子需求的Diels-Alder反应形成oxadecalin中间体4(逆电子D-A反应详见往期推荐1)，Tsn15进一步催化了分子内重排反应形成终产物中的四氢吡喃。Tsn15晶体结构的解析工作进一步表明其催化下的周环重排机理。Tsn15对其活性位点突变的耐受性及其蛋白质折叠催化的多种反应范围进一步表明其可能具有生物催化剂的潜力。
Fig 1. The proposed roleof the [4+2] cyclasehomologues Tsn11 and Tsn15 in tetronasin biosynthesis.
5: 参考文献： https://www.nature.com/articles/s41929-019-0351-2
聚醚抗生素Tetronasin (1)产于Streptomyces longisporoflavus，是一种罕见的含有酰基特窗酸部分的聚醚离子载体(特窗酸、特窗胺及其衍生物均是生物活性很高的五元杂环化合物，具有重要的研究与实用价值)，已发现可用作抗生素和抗寄生虫剂。Tetronasin(1)的生物合成部分历程已经得到推测或阐明(Fig 1)，诸如其结构中聚酮骨架的合成（2）、特窗酸与四氢呋喃结构的形成（3）。然而其结构中更为复杂的双环体系-环己烷与四氢吡喃的生物合成分子基础一直不为人知。
Fig 1. The proposed roleof the [4+2] cyclasehomologues Tsn11 and Tsn15 in tetronasin biosynthesis.自然界中，包括抗生素spirotetronate和spirotetramate在内的很多天然产物的复杂多环结构均依赖一类[4+2]环化酶(Diels-Alderase)催化的Diels–Alder反应，由富电性的共轭二烯与缺电性的亲二烯体通过[4+2]环化加成得到。据此，本文作者首先对Tetronasin的基因簇(tsn)进行了详尽的生物信息学分析，他们惊讶地发现其中存在两个未知酶（Tsn11与Tsn15）均与[4+2]环化酶具有一定的同源性(Fig 2a)，随即对Tsn11和Tsn15的基因敲除和回补实验发现Tsn11和Tsn15对产生终产物1必不可少(Fig 2b)，同时积累到少量的中间体3。接下来，他们对这两个酶进行了异源表达并详细验证了Tsn11和Tsn15的体外活性： Tsn11催化了非经典的逆电子需求的Diels-Alder反应将3转化为4，而Tsn15可能负责了4的进一步分子内重排反应产生终产物1。
Fig 2. Functional characterizationof the Diels-alderase homologues Tsn11 and Tsn15 in tetronasin biosynthesis.
为了进一步了解Tsn15催化重排的反应机理，作者分别获得了Tsn15和与底物4的共结晶的晶体结构。他们发现Tsn15单体通过N端α螺旋的相互作用形成二聚体，而C端的β-桶状结构域形成了疏水的空腔容纳了底物。此外，他们发现共结晶后的底物并不是预期的底物4，而是已经经历了自发脱水形成了“酶促反应惰性”的5。他们随即通过突变空腔内的可能的催化位点，证明了Tsn15催化的反应并不属于酸/碱的催化机理，反而W190与5中oxadecalin结构的π-堆积相互作用是催化活性的关键，这暗示了预期底物4在Tsn15催化的反应过程中极有可能是通过由空腔疏水作用介导的周环重排反应而产生终产物1。此外，尽管4与5的相互转化过程是否是Tsn15介导的酶促反应仍然不明，但作者推测5可能是Tsn15的真实底物，因为4中半缩醛的脱水对后续的重排反应过程可能形成的阴离子具有稳定化作用。
Fig 3. Structure ofTsn15 and a Tsn15-substrate complex and a proposed mechanism for formation ofthe cyclohexane and tetrahydropyran rings of tetronasin.综上，本文发现酶Tsn11催化逆电子需求的杂Diels-Alder反应，而与已知Diels-Alderase环化酶在结构上同源的Tsn15已经进化出催化不同反应的功能（但也可能是周环反应）。从合成生物学的角度来看，这些酶可用于立体合成聚醚离子载体类似物中的环己烷和四氢吡喃部分。Tsn15对其活性位点突变的耐受性及其蛋白质折叠催化的多种反应范围进一步表明其可能具有生物催化剂的潜力。同时，这些发现表明，在天然产物的生物合成途径中仍存在更多新的和潜在的酶促周环反应例子。
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