蛋白质的生产是学术界和工业界研究的重要组成部分，可以通过生物学方法或化学合成来完成。大多数蛋白质是通过生物表达获得的，该过程很大程度上限制了其化学组成到典型的蛋白原氨基酸上。遗传密码扩展前进已允许在天然蛋白质的结构中掺入多达两个非天然氨基酸。相比之下，当需要整合多个非天然氨基酸，翻译后修饰或人工骨架时，化学合成可提供无与伦比的灵活性。合成蛋白已经可以使用通过固相和结扎方法的结合。然而，蛋白质的总体化学合成仍保持高度劳动密集型。
由于无效的偶联和副反应，长约50个氨基酸均质肽的固相肽合成一直是长期的挑战。近日，Science杂志刊登了由麻省理工学院Hartrampf和Pentelute教授团队最新成果。他们使用自动化化学平台优化快速流动肽合成（即AFPS，优化传统的固相态肽合成（SPPS）），并能够产生完全合成的单结构域蛋白。它们报告了高效的化学反应，以及与自动快速流动仪器相匹配的化学物质，可直接制造长达327个连续反应的164个氨基酸肽链。机器运行迅速：数小时内完成肽链的延伸。他们通过化学合成九种代表酶，结构单位和调节因子的不同蛋白质链来证明该方法的实用性。纯化和折叠后，合成材料显示出与生物表达蛋白质相当的生物物理和酶促性。高保真自动流动化学是生产无核糖体的单域蛋白的替代方法。相关链接发表在：DOI: 10.1126/science.abb2491这篇文章报告了一个常规方案，该方案允许逐步化学合成长度超过50个氨基酸的肽链，每个氨基酸的循环时间约为2.5分钟（图1（A））。优化方案建立在通过AFPS系统获取的分析数据集合的基础上，可提供高保真度和高手性纯度的产品。使用该方案，可以在3.5至6.5小时内合成从芽孢杆菌RNA酶抑制剂（90个氨基酸）到分选酶A59-206（分选酶A*，164个氨基酸）的单域蛋白链。为了证明功能蛋白的产生，将这些序列折叠，并确定了它们的生物物理特性和酶活性。化学蛋白质合成的时间尺度与重组表达的时6间尺度相等，因此为生物化学方法提供了一种实用的替代方法，同时开辟了超出规范氨基酸的化学空间。作者首先优化了常规参数，包括流速，反应溶剂，试剂浓度，温度和偶联剂（图1B）。研究了不同活化剂在偶联步骤中的性能。还筛选了温度，时间和活化剂以及不同的侧链保护基团的影响（图1C和D）。对于这两种氨基酸，差向异构体随激活时间和温度而增加。事实证明，保护基团的选择对于组氨酸至关重要。接着，作者确定了在这些优化条件下差向异构化作用的数量不会在多个偶联循环中增加（图1E）。图1. 自动快速流动固相肽合成的优化条件可实现长氨基酸序列的高保真度生产。作者继续调查了优化的AFPS条件是否可以用胰岛素原（86个氨基酸）和人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）蛋白酶（99个氨基酸）作为测试序列来促进更长序列的合成。使用他们标准的AFPS方案，胰岛素原和HIV-1蛋白酶的合成分别在3.5和4.5小时内完成。高效液相色谱(HPLC)纯化产生2.2 mg（1％）的纯化胰岛素原和5.3 mg（1％）的纯化HIV-1蛋白酶。在室温，70°C和90°C的商用合成器上进行AFPS和标准一批次的SPPS合成之间的比较表明，优化的AFPS方案的合成效果得到了显着改善（图2） 。图2. 胰岛素原和HIV-1蛋白酶的合成证明了AFPS优于传统SPPS方法的优势。化学变性可用于评估合成蛋白的结构完整性和稳定性。球状蛋白芽孢杆菌RNA酶（从解淀粉芽孢杆菌分离自细菌核糖核酸酶（RNase））是一个以研究蛋白质折叠，变性，并结合其抑制蛋白芽孢杆菌RNA酶抑制剂模型系统（图4A ）。通过液相层析串联质谱(LC-MS)和HPLC方法无法区分合成和重组白芽孢杆菌RNA酶的一级结构（图4B ）。使用化学变性荧光测定法作为三级结构完整性的读数器（图4C ）。图4. 合成的芽孢杆菌RNA酶抑制剂和芽孢杆菌RNA酶抑制剂折叠成天然三级结构，并显示出与重组样品相当的酶活性。HIV-1蛋白酶的一级结构通过LC-MS和HPLC方法确认（图5B）。HIV-1蛋白酶水解HIV的肽，使用荧光肽可以量化其蛋白水解活性。合成的HIV-1蛋白酶的米氏常数（MIchaelis constant）为KM = 20.9 ± 1.0 μM，周转数kcat = 29.6 ± 4.1 s-1，接近于相似文献中发表通过SPPS获得合成样品的数值（图5C）。将合成模型底物肽蛋白酶孵育，可产生类似野生型的在单个Phe-Pro位点上进行独有分裂的特异性（图5D）。图5. 包含三个非规范氨基酸的合成HIV-1蛋白酶折叠成天然二聚体结构，并显示出与文献样品相当的酶促活性和底物特异性。经过优化的AFPS方案证明了流动化学优于常规一批处理的方法，所产生的肽链比常规标准SPPS可获得的肽链长三倍以上。通过在可重现的反应装置中快速筛选变量，实现了对现有流程方案的改进。自实施AFPS以来，作者已经生产了5000多种肽，并自动收集了所有合成的在线分析数据。展望未来，可以通过机器学习和其他计算方法来利用这一广泛的高质量数据集来进一步改善流程中的肽合成。强大而广泛使用的常规化学生产蛋白质的方法有望对化学生物学和新疗法的发展产生重大影响。最后，AFPS具有按需按时生产的潜力，并可能挽救生命的个性化药物，例如用酶替代疗法或新抗原的癌症疫苗。
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